Një mënyrë e re për të parë aktivitetin brenda një qelize të gjallë

Qelizat e gjalla bombardohen me shumë lloje sinjalesh molekulare hyrëse që ndikojnë në sjelljen e tyre. Të qenit në gjendje për të matur ato sinjale dhe mënyrën se si qelizat reagojnë ndaj tyre përmes rrjeteve të sinjalizimit molekular në rrjedhën e poshtme, mund t’i ndihmojë shkencëtarët të mësojnë shumë më tepër se si funksionojnë qelizat, duke përfshirë atë që ndodh ndërsa plaken ose sëmuren.

Tani për tani, ky lloj studimi gjithëpërfshirës nuk është i mundur sepse teknikat aktuale për imazhin e qelizave janë të kufizuara në vetëm një pjesë të vogël të llojeve të ndryshme të molekulave brenda një qelize në të njëjtën kohë. Megjithatë, studiuesit e MIT kanë zhvilluar një metodë alternative që u lejon atyre të vëzhgojnë deri në shtatë molekula të ndryshme në të njëjtën kohë, dhe potencialisht edhe më shumë se kaq.

“Ka shumë shembuj në biologji ku një ngjarje shkakton një kaskadë të gjatë në rrjedhën e poshtme të ngjarjeve, e cila më pas shkakton një funksion specifik qelizor,” thotë Edward Boyden, profesor i Y. Eva Tan në Neuroteknologji. “Si ndodh kjo? Është padyshim një nga problemet themelore të biologjisë, dhe kështu ne pyesim veten, a mund ta shikoni thjesht të ndodhë?”

Qasja e re përdor molekulat fluoreshente jeshile ose të kuqe që dridhen dhe fiken me ritme të ndryshme. Duke imazhuar një qelizë për disa sekonda, minuta ose orë, dhe më pas duke nxjerrë secilin prej sinjaleve fluoreshente duke përdorur një algoritëm llogaritës, sasia e çdo proteine ​​të synuar mund të gjurmohet ndërsa ndryshon me kalimin e kohës.

Boyden, i cili është gjithashtu profesor i inxhinierisë biologjike dhe i shkencave të trurit dhe njohjes në MIT, hetues i Institutit Mjekësor Howard Hughes dhe anëtar i Institutit McGovern të MIT për Kërkimin e Trurit dhe Institutit Koch për Kërkimin Integrativ të Kancerit, si dhe bashkë- drejtor i Qendrës K. Lisa Yang për Bionics, është autori kryesor i studimit, i cili shfaqet në Cell . MIT postdokues Yong Qian është autori kryesor i punimit .

Etiketimi i molekulave brenda qelizave me proteina fluoreshente i ka lejuar studiuesit të mësojnë shumë rreth funksioneve të shumë molekulave qelizore. Ky lloj studimi shpesh bëhet me proteinën fluoreshente jeshile (GFP), e cila u vendos për herë të parë për imazhe në vitet 1990. Që atëherë, disa proteina fluoreshente që shkëlqejnë me ngjyra të tjera janë zhvilluar për përdorim eksperimental.

Megjithatë, një mikroskop tipik drite mund të dallojë vetëm dy ose tre nga këto ngjyra, duke u lejuar studiuesve vetëm një paraqitje të vogël të aktivitetit të përgjithshëm që po ndodh brenda një qelize. Nëse ata mund të gjurmonin një numër më të madh molekulash të etiketuara, studiuesit mund të masin përgjigjen e një qelize të trurit ndaj neurotransmetuesve të ndryshëm gjatë mësimit, për shembull, ose të hetojnë sinjalet që nxisin një qelizë kanceroze të metastazojë.

“Idealisht, ju do të jeni në gjendje të shikoni sinjalet në një qelizë ndërsa ato luhaten në kohë reale, dhe më pas mund të kuptoni se si ato lidhen me njëri-tjetrin. Kjo do t’ju tregonte se si qeliza llogarit,” thotë Boyden. “Problemi është se nuk mund të shikosh shumë gjëra në të njëjtën kohë.”

Në vitin 2020, laboratori i Boyden zhvilloi një mënyrë për të imazhuar njëkohësisht deri në pesë molekula të ndryshme brenda një qelize, duke synuar reporterët e ndezur në vende të ndryshme brenda qelizës. Kjo qasje, e njohur si ” multipleksimi hapësinor “, i lejon studiuesit të dallojnë sinjalet për molekula të ndryshme edhe pse ato mund të jenë të gjitha fluoreshuese me të njëjtën ngjyrë.

Në studimin e ri, studiuesit morën një qasje të ndryshme: në vend që të dallonin sinjalet bazuar në vendndodhjen e tyre fizike, ata krijuan sinjale fluoreshente që ndryshojnë me kalimin e kohës. Teknika mbështetet në “fluoroforet e ndërrueshme” – proteinat fluoreshente që ndizen dhe fiken me një ritëm specifik.

Për këtë studim, Boyden dhe anëtarët e grupit të tij identifikuan katër fluorofore të kalueshme jeshile dhe më pas projektuan dy të tjera, të cilat të gjitha ndizen dhe fiken me ritme të ndryshme. Ata identifikuan gjithashtu dy proteina fluoreshente të kuqe që ndërrohen me shpejtësi të ndryshme dhe krijuan një fluorofore shtesë të kuqe.

Secila prej këtyre fluoroforeve të ndërrueshme mund të përdoret për të etiketuar një lloj të ndryshëm molekule brenda një qelize të gjallë, një enzimë të tillë, proteinë sinjalizuese ose pjesë të citoskeletit qelizor. Pas imazhit të qelizës për disa minuta, orë apo edhe ditë, studiuesit përdorin një algoritëm llogaritës për të zgjedhur sinjalin specifik nga çdo fluorofore, analoge me mënyrën se si veshi i njeriut mund të dallojë frekuenca të ndryshme tingulli.

“Në një orkestër simfonike , ju keni instrumente me zë të lartë, si flauti, dhe instrumente me zë të ulët, si një tuba. Dhe në mes janë instrumente si boria. Ata të gjithë kanë tinguj të ndryshëm dhe veshi ynë i rendit ato. “, thotë Boyden.

Teknika matematikore që studiuesit përdorën për të analizuar sinjalet fluorofore njihet si mospërzierje lineare. Kjo metodë mund të nxjerrë sinjale të ndryshme fluorofore, të ngjashme me mënyrën se si veshi i njeriut përdor një model matematikor të njohur si transformimi Fourier për të nxjerrë zëra të ndryshëm nga një pjesë muzikore.

Pasi të përfundojë kjo analizë, studiuesit mund të shohin se kur dhe ku secila prej molekulave të etiketuara me fluoreshente u gjet në qelizë gjatë gjithë periudhës së imazhit. Vetë imazhi mund të bëhet me një mikroskop të thjeshtë drite, pa asnjë pajisje të specializuar.

Në këtë studim, studiuesit demonstruan qasjen e tyre duke etiketuar gjashtë molekula të ndryshme të përfshira në ciklin e ndarjes qelizore, në qelizat e gjitarëve. Kjo i lejoi ata të identifikonin modele se si ndryshojnë nivelet e enzimave të quajtura kinaza të varura nga ciklina ndërsa një qelizë përparon përmes ciklit qelizor.

Studiuesit treguan gjithashtu se ata mund të etiketojnë lloje të tjera të kinazave, të cilat janë të përfshira në pothuajse çdo aspekt të sinjalizimit të qelizave, si dhe strukturat dhe organelet qelizore si citoskeleti dhe mitokondria. Përveç eksperimenteve të tyre duke përdorur qelizat e gjitarëve të rritur në një pjatë laboratorike, studiuesit treguan se kjo teknikë mund të funksionojë në trurin e larvave të zebrafish.

Sipas studiuesve, kjo metodë mund të jetë e dobishme për të vëzhguar se si qelizat reagojnë ndaj çdo lloj inputi, siç janë lëndët ushqyese, faktorët e sistemit imunitar, hormonet ose neurotransmetuesit. Mund të përdoret gjithashtu për të studiuar se si qelizat reagojnë ndaj ndryshimeve në shprehjen e gjeneve ose mutacioneve gjenetike. Të gjithë këta faktorë luajnë rol të rëndësishëm në fenomene biologjike si rritja, plakja, kanceri, neurodegjenerimi dhe formimi i kujtesës.

“Ju mund t’i konsideroni të gjitha këto dukuri si një klasë të përgjithshme të problemit biologjik, ku një ngjarje afatshkurtër – si ngrënia e një lënde ushqyese, mësimi i diçkaje ose marrja e një infeksioni – gjeneron një ndryshim afatgjatë,” thotë Boyden.

Përveç ndjekjes së këtyre llojeve të studimeve, laboratori i Boyden po punon gjithashtu në zgjerimin e repertorit të fluoroforeve të ndërrueshme në mënyrë që ata të mund të studiojnë edhe më shumë sinjale brenda një qelize. Ata gjithashtu shpresojnë të përshtatin sistemin në mënyrë që të mund të përdoret në modelet e miut.