Shkencëtarët modifikojnë me sukses gjenet e viruseve që infektojnë bakteret

CRISPR, mjeti revolucionar i modifikimit të gjeneve, po bën bujë në komunitetin shkencor edhe një herë me potencialin e tij për të redaktuar gjenomet e viruseve që infektojnë bakteret.

I udhëhequr nga pionierët e CRISPR, Jennifer Doudna dhe Jill Banfield, një ekip ka përdorur një formë të rrallë të CRISPR për të inxhinieruar bakteriofagët me porosi, një zhvillim që mund të ndihmojë në trajtimin e infeksioneve rezistente ndaj ilaçeve dhe të lejojë studiuesit të kontrollojnë mikrobiomet pa përdorimin e antibiotikëve. Hulumtimi, i botuar në Nature Microbiology, përfaqëson një arritje të rëndësishme pasi inxhinieria e bakterofagëve ka qenë prej kohësh një sfidë për komunitetin shkencor.

“Bakteriofagët janë disa nga entitetet biologjike më të bollshme dhe të larmishme në Tokë. Ndryshe nga qasjet e mëparshme, kjo strategji redaktimi funksionon kundër diversitetit të jashtëzakonshëm gjenetik të bakteriofagëve, “tha autori i parë Benjamin Adler, një student postdoktoral në laboratorin e Doudna. “Ka kaq shumë drejtime emocionuese këtu – zbulimi është fjalë për fjalë në majë të gishtave!”

Bakteriofagët, të quajtur thjesht fagë, futin materialin e tyre gjenetik në qelizat bakteriale duke përdorur një aparat të ngjashëm me shiringën, pastaj rrëmbejnë makinerinë e ndërtimit të proteinave të pritësve të tyre në mënyrë që të riprodhohen – zakonisht duke vrarë bakteret në proces. (Ato janë të padëmshme për organizmat e tjerë, duke përfshirë ne njerëzit, edhe pse imazhet e mikroskopisë elektronike kanë zbuluar se ato duken si anije kozmike të liga aliene.)

CRISPR-Cas është një lloj mekanizmi mbrojtës imunitar që shumë baktere dhe arkea përdorin kundër fagëve. Një sistem CRISPR-Cas përbëhet nga copa të shkurtra të ARN-së që janë plotësuese me sekuencat në gjenet e fagut, duke i lejuar mikrobit të njohë kur është futur materiali gjenetik invaziv, dhe enzima të ngjashme me gërshërët që neutralizojnë gjenet e fagut duke i prerë në copa të padëmshme. pasi udhëhiqet në vend nga ARN.

Gjatë mijëvjeçarëve, beteja e përhershme evolucionare midis sulmit të fagut dhe mbrojtjes bakteriale i detyroi fagët të specializoheshin. Ka shumë mikrobe, kështu që ka edhe shumë fagë, secili me përshtatje unike. Ky diversitet mahnitës e ka bërë të vështirë redaktimin e fagut, duke përfshirë rezistencën e tyre ndaj shumë formave të CRISPR, prandaj sistemi më i përdorur – CRISPR-Cas9 – nuk funksionon për këtë aplikacion.

“Fagët kanë shumë mënyra për t’iu shmangur mbrojtjeve, duke filluar nga anti-CRISPRs deri tek të qenit të mirë në riparimin e ADN-së së tyre,” tha Adler. “Pra, në një farë kuptimi, përshtatjet e koduara në gjenomet e fagut që i bëjnë ata kaq të mirë në manipulimin e mikrobeve janë pikërisht e njëjta arsye pse ka qenë kaq e vështirë të zhvillohet një mjet me qëllim të përgjithshëm për modifikimin e gjenomit të tyre.”

Udhëheqësit e projektit Doudna dhe Banfield kanë zhvilluar së bashku mjete të shumta të bazuara në CRISPR që kur ata bashkëpunuan për herë të parë në një hetim të hershëm të CRISPR në 2008. Kjo punë – e kryer në Laboratorin Kombëtar Lawrence Berkeley (Berkeley Lab) – u citua nga komiteti i çmimit Nobel kur Doudna dhe bashkëpunëtorja tjetër e saj, Emmanuelle Charpentier, mori çmimin në vitin 2020. Ekipi i Doudna dhe Banfield i studiuesve të Berkeley Lab dhe UC Berkeley po studionin vetitë e një forme të rrallë të CRISPR të quajtur CRISPR-Cas13 (që rrjedh nga një bakter që zakonisht gjendet në gojën e njeriut) kur zbuluan se ky version i sistemit të mbrojtjes funksionon kundër një game të madhe fagësh.

Fuqia kundër fagëve të CRISPR-Cas13 ishte e papritur duke pasur parasysh se sa pak mikrobe e përdorin atë, shpjegoi Adler. Shkencëtarët u befasuan dyfish sepse fagët që ai mundi gjatë testimit infektojnë të gjithë duke përdorur ADN me dy fije, por sistemi CRISPR-Cas13 synon dhe copëton vetëm ARN virale me një zinxhir. Ashtu si llojet e tjera të viruseve, disa fagë kanë gjenom të bazuar në ADN dhe disa kanë gjenomë të bazuar në ARN. Megjithatë, të gjithë viruset e njohur përdorin ARN për të shprehur gjenet e tyre. Sistemi CRISPR-Cas13 neutralizoi në mënyrë efektive nëntë fagë të ndryshëm të ADN-së që të gjithë infektojnë shtamet e E. coli, por nuk kanë pothuajse asnjë ngjashmëri në gjenomin e tyre.

Sipas bashkautorit dhe ekspertit të fagut Vivek Mutalik, një shkencëtar i stafit në Zonën e Bioshkencës së Berkeley Lab, këto gjetje tregojnë se sistemi CRISPR mund të mbrohet kundër fagëve të ndryshëm të bazuar në ADN duke synuar ARN-në e tyre pasi të jetë konvertuar nga ADN-ja nga vetë bakteret. enzimat para përkthimit të proteinave.

Më pas, ekipi tregoi se sistemi mund të përdoret për të modifikuar gjenomet e fagut në vend që thjesht t’i copëtojë ato në mënyrë mbrojtëse.

Së pari, ata bënë segmente të ADN-së të përbërë nga sekuenca e fagut që donin të krijonin të rrethuar nga sekuenca të fagut vendas dhe i vendosën ato në bakteret e synuara të fagut. Kur fagët infektuan mikrobet e ngarkuara me ADN, një përqindje e vogël e fagëve që riprodhoheshin brenda mikrobeve morën ADN-në e ndryshuar dhe e inkorporuan atë në gjenomin e tyre në vend të sekuencës origjinale. Ky hap është një teknikë e vjetër e redaktimit të ADN-së e quajtur rikombinim homolog. Problemi me dekada në kërkimin e fagut është se megjithëse ky hap, redaktimi aktual i gjenomit të fagut, funksionon mirë, izolimi dhe përsëritja e fagëve me sekuencën e redaktuar nga grupi më i madh i fagëve normalë është shumë i ndërlikuar.

Këtu hyn CRISPR-Cas13. Në hapin e dytë, shkencëtarët krijuan një lloj tjetër mikrobi pritës për të përmbajtur një sistem CRISPR-Cas13 që ndjen dhe mbron nga sekuenca normale e gjenomit të fagut. Kur fagët e bërë në hapin e parë u ekspozuan ndaj pritësve të raundit të dytë, fagët me sekuencën origjinale u mundën nga sistemi i mbrojtjes CRISPR, por numri i vogël i fagëve të redaktuar ishte në gjendje ta shmangte atë. Ata mbijetuan dhe riprodhuan veten.

Eksperimentet me tre fagë të palidhur E. coli treguan një shkallë suksesi marramendëse: më shumë se 99% e fagëve të prodhuar në proceset me dy hapa përmbanin modifikimet, të cilat varionin nga fshirjet e mëdha të shumëgjeneve deri te zëvendësimet e sakta të një të vetme. amino acid.

“Për mendimin tim, kjo punë në inxhinierinë e fagut është një nga momentet kryesore në biologjinë e fagut,” tha Mutalik. “Ndërsa fagët ndikojnë në ekologjinë mikrobike, evolucionin, dinamikën e popullsisë dhe virulencën, inxhinieria pa probleme e baktereve dhe fagëve të tyre ka implikime të thella për shkencën themelore, por gjithashtu ka potencialin për të bërë një ndryshim të vërtetë në të gjitha aspektet e bioekonomisë. Përveç shëndetit të njeriut, kjo aftësi inxhinierike e fagut do të ndikojë në gjithçka, nga prodhimi biologjik dhe bujqësia deri te prodhimi i ushqimit.”

Të nxitur nga rezultatet e tyre fillestare, shkencëtarët aktualisht po punojnë për të zgjeruar sistemin CRISPR për ta përdorur atë në më shumë lloje fagësh, duke filluar me ato që ndikojnë në komunitetet mikrobike të tokës. Ata gjithashtu po e përdorin atë si një mjet për të eksploruar misteret gjenetike brenda gjenomave të fagut. Kush e di se cilat mjete dhe teknologji të tjera të mahnitshme mund të frymëzohen nga plaçka e luftës mikroskopike midis baktereve dhe viruseve?