Baza strukturore për mbikëqyrjen e mospërputhjes nga CRISPR–Cas9
CRISPR–Cas9 si një mjet i programueshëm për modifikimin e gjenomit pengohet nga ndarja e ADN-së jashtë objektivit1,2,3,4, dhe mekanizmat themelorë me të cilët Cas9 njeh mospërputhjet janë kuptuar keq5,6,7. Megjithëse janë projektuar variante Cas9 me diskriminim më të madh ndaj mospërputhjeve8,9,10, këto vuajnë nga ritme të reduktuara ndjeshëm të ndarjes së ADN-së në shënjestër5,11. Këtu kemi përdorur mikroskopin krio-elektroni të drejtuar nga kinetika për të përcaktuar strukturën e Cas9 në faza të ndryshme të ndarjes së mospërputhjes. Ne vëzhguam një konformacion të veçantë linear të dupleksit udhëzues ARN-ADN të formuar në prani të mospërputhjeve, gjë që parandalon aktivizimin e Cas9. Megjithëse konformimi i dyfishtë i udhëzuesit kanonik të përthyer ARN-ADN lehtëson ndarjen e ADN-së, ne vërejmë se substratet që përmbajnë mospërputhje distale me motivin ngjitur të protospacerit stabilizohen nga riorganizimi i një laku në domenin RuvC. Mutagjeneza e mbetjeve që stabilizojnë mospërputhjen redukton ndarjen e ADN-së jashtë objektivit, por ruan ndarjen e shpejtë të ADN-së në objektiv. Duke synuar rajonet që janë ekskluzivisht të përfshira në tolerancën e mospërputhjes, ne ofrojmë një provë të konceptit për dizajnimin e varianteve Cas9 me besueshmëri të lartë të gjeneratës së ardhshme.
Për aplikimet terapeutike të CRISPR-Cas9, ndarja e ADN-së jashtë objektivit duhet të minimizohet1,2,3. Megjithëse janë zhvilluar një sërë variantesh Cas9 me besnikëri të lartë me diskriminim të përmirësuar të mospërputhjes7,9, specifika e tyre e zgjeruar vjen me koston e shkallës së reduktuar rëndë të ndarjes së ADN-së në shënjestër5,11. Mospërputhjet nxisin konformacione alternative Cas912,13; megjithatë, strukturat e përdorura për të udhëhequr ridizajnimin racional të varianteve të tilla ishin të lidhura me ADN-në e synuar dhe në konformacionet joaktive14,15. Për të kuptuar mekanizmat molekularë që rregullojnë njohjen jashtë objektivit, këtu kemi përdorur analizën kinetike për të udhëhequr përgatitjen e mostrës për mikroskopinë krio-elektronike (cryo-EM) dhe kemi marrë pamjet strukturore të ndërmjetësve të aktivizimit të para-ndarjes Cas9 në prani të ARN-ve të ndryshme udhëzuese – Mospërputhjet e vargut të synuar të ADN-së (gRNA-TS).