Ekipi përdor inteligjencën artificiale AlphaFold për të ridizenjuar proteinat e modifikimit të gjeneve, duke i bërë ato më të sigurta

Disa dekada pas zbulimit të sistemeve që mund të synojnë në mënyrë selektive ADN-në, po fillojmë të shohim terapitë e para të bazuara në redaktimin e gjeneve. Një sfidë me të cilën janë përballur këto zhvillime është siguria. Ndërsa mund t’i bëjmë ato mjaft specifike për gjenin që duam të redaktohet, gjenomi njerëzor është shumë i madh dhe madje edhe sekuencat e rralla të ADN-së mund të shfaqen disa herë rastësisht.

Si rezultat, të gjitha sistemet origjinale të redaktimit të gjeneve kishin shkallë të njohura të atyre që quhen efekte jashtë objektivit, në të cilat ato thjesht redaktojnë sekuencën e gabuar. Kjo mund të jetë një ngjarje me probabilitet të ulët, por modifikimi i mjaftueshëm i qelizave – dhe terapitë në përgjithësi duhet të modifikojnë shumë – dhe gabimet bëhen të pashmangshme.

Janë bërë shumë përpjekje për të gjetur mënyra për të minimizuar ose eliminuar ndryshimet jashtë objektivit. Në një numër të kohëve të fundit të revistës Nature, studiuesit përshkruan modifikimin e softuerit AlphaFold për palosjen e proteinave të inteligjencës artificiale për të ndihmuar në identifikimin e zonave kryesore të proteinave të modifikimit të gjeneve përgjegjëse për efektet jashtë objektivit. Këto zona u modifikuan më pas për të zvogëluar problemet.

Sistemet e redaktimit të gjeneve kanë tre komponentë kryesorë. E para është ARN-ja udhëzuese, e cila mund të çiftëzohet me sekuencën e gjenomit të synuar. Është e mundur të projektohen shumë ARN udhëzuese që të gjitha synojnë të njëjtin gjen, kështu që një qasje për ta bërë sistemin më të sigurt është të zgjidhen sekuenca që nuk ndajnë shumë ngjashmëri me asnjë vendndodhje tjetër gjenomike. Kjo tani përdoret gjerësisht si pjesë e procesit bazë të projektimit për një sistem redaktimi të gjeneve.

Komponenti i dytë është një proteinë Cas e emëruar sipas proteinës Cas9 të sistemit CRISPR. Ajo bashkëvepron si me ARN-në udhëzuese ashtu edhe me ARN-në gjenomike dhe ndihmon në përforcimin e specifikës së ndërveprimeve.

Nëse ka shumë mospërputhje në çiftëzimin e bazave midis ARN-së dhe ADN-së, Cas9 (ose anëtarë të tjerë të familjes Cas) nuk do të qëndrojnë aty. Qasje të ndryshme kanë çuar në përmirësimin e anëtarëve të familjes Cas që kanë zvogëluar tendencën për të mundësuar redaktime jashtë objektivit.

Komponenti i fundit kyç i sistemit është proteina që bashkëvepron me Cas9 kur lidhet me ADN-në dhe e modifikon atë. Në sistemin origjinal CRISPR, kjo i preu të dy fijet e spirales së dyfishtë, duke prodhuar dëmtime që janë të vështira për t’u kontrolluar. Që atëherë, studiuesit kanë modifikuar proteina të tjera për të bashkëvepruar me Cas9, por kanë katalizuar ndryshime më delikate në ADN, të tilla si prerja e një baze të vetme ose bërja e modifikimeve kimike që ndryshojnë mënyrën se si çiftëzohet baza.

Në përgjithësi, gjatësia e çiftëzimit të bazave midis ARN-ve udhëzuese dhe gjenomit është rreth 18 baza. Kjo duhet të shfaqet në sekuencat e rastësishme të ADN-së vetëm rreth një herë në 70 miliardë baza, dhe gjenomi ynë është vetëm rreth 3 miliardë baza. Me këtë masë, duhet të jemi mirë. Por rezulton se Cas9 mund të tolerojë një numër të vogël bazash të çiftëzuara gabimisht pa humbur aftësinë e tij për t’u ngjitur në ADN. Numri dhe vendndodhja e saktë e bazave ku tolerohen variacionet mund të ndryshojë disi, duke e bërë të vështirë identifikimin paraprak të ARN-ve udhëzuese që mund të paraqesin rrezik.

Një rrugë për të përmirësuar sigurinë është të kuptohet më mirë se si ndodhin këto ndërveprime jashtë objektivit.

Ekipi që qëndron pas punës së re, i bazuar në një sërë institucionesh në Kinë, e arsyetoi paraprakisht qasjen e tyre. Një hibrid ADN-ARN i përputhur në mënyrë të përkryer do të ketë një strukturë, ndërsa një me një ose më shumë baza të çiftëzuara gabimisht do të ketë një strukturë paksa të ndryshme. Evolucioni ka optimizuar strukturën e Cas9 për t’iu përmbajtur të parës. Por me sa duket kjo nuk e ka penguar Cas9 të përvetësojë konformacione paksa të ndryshme që mund të bashkëveprojnë me strukturat e çiftëzuara gabimisht.

Nëse mund të identifikojmë pjesët e Cas9 që ndërmjetësojnë këto ndërveprime problematike, mund t’i modifikojmë dhe potencialisht t’i bllokojmë ato.

Hapi i parë i ekipit ishte ndërtimi i një biblioteke të madhe me vende redaktimi jashtë objektivit. Ata e bënë këtë duke përdorur një sistem të modifikuar CRISPR që konverton bazën e ADN-së adeninë në një kimikat të ngjashëm, inozinë, dhe më pas duke izoluar çdo fragment ADN-je që e përmban atë. Ata e përsëritën këtë proces me 10 ARN udhëzuese të ndryshme dhe analizuan një numër të madh fragmentesh ADN-je të modifikuara nga secila për të marrë një pamje të gjerë të llojeve të sekuencave jashtë objektivit të pranishme.

Hapi tjetër ishte të shqyrtohej se si kompleksi CRISPR ndërvepronte me to, duke përdorur softuerin e palosjes së proteinave të bazuar në inteligjencën artificiale AlphaFold. Versionet e përditësuara u projektuan për të trajtuar ndërveprimet midis proteinave dhe acideve nukleike, si dhe komplekseve të proteinave të shumëfishta. Kështu që ekipi ushqente versionet AlphaFold të një sekuence ADN-je të synuar, së bashku me një ARN udhëzuese, sekuencën Cas9 dhe një enzimë që modifikon kimikisht bazat dhe mund të ngjitet në Cas9.

Fatkeqësisht, ajo u mbyt, duke e vendosur njërën nga proteinat në atë që ishte qartësisht vendi i gabuar.

Pa u dekurajuar, ekipi i thjeshtoi gjërat dhe i dha AlphaFold vetëm ADN-në, ARN-në dhe proteinën Cas9, meqenëse kjo e fundit është faktori kryesor që përcakton specifikën e sekuencës së saj. Kjo funksionoi shumë më mirë, duke prodhuar një strukturë që përputhej me ato të përcaktuara nga eksperimentet me acide dhe proteina nukleike aktuale.

Duke krahasuar strukturat e gjeneruara nga AlphaFold kur ushqeheshin me vende të ndryshme në dhe jashtë shënjestrës, studiuesit gjetën një model të përgjithshëm. Shumë (rreth dy të tretat) e vendeve jashtë shënjestrës bënë që proteina Cas9 të përvetësonte një strukturë paksa të ndryshme. Por pothuajse të gjitha (mbi 95 përqind) e tyre ndryshuan se cilat aminoacide kontaktuan ARN-në. Pra, ka qartë disa raste ku Cas9 ruan strukturën e saj normale, por aminoacidet brenda saj përkulen në mënyra që akomodojnë bazat e çiftëzuara gabimisht të vendeve jashtë shënjestrës.

Në mënyrë të përshtatshme, AlphaFold ishte konfiguruar tashmë për të identifikuar atë që quhet “probabiliteti i kontaktit”, domethënë, mundësinë që çdo dy artikuj, të tillë si aminoacidet ose nukleotidet, të jenë brenda një distance shumë të vogël (tetë Angstrom). Studiuesit mund të merrnin rezultatin e analizës së probabilitetit të kontaktit për vendet në dhe jashtë objektivit dhe t’i krahasonin ato, duke identifikuar saktësisht se cilat aminoacide në Cas9 kanë ndryshuar kontaktet kur ka një mospërputhje midis ARN-së udhëzuese dhe ADN-së. Ata e quajtën këtë konfigurim të analizës kompjuterike “ContactSeek”.

Më vete, ContactSeek tentonte të prodhonte një listë të madhe aminoacidesh që zhvendosen kur lidhen në një vend jashtë objektivit. Kështu që studiuesit u përqendruan në rajonet e proteinës Cas9 ku këto aminoacide grumbulloheshin, duke e parë këtë si një shenjë se këto zona po përshtateshin me ndryshimet e shkaktuara nga bazat e papërputhshme. Pastaj ata filluan të testonin versione të Cas9 me aminoacide të ndryshme në këto vende.

Në total, studiuesit bënë 23 ndërrime të ndryshme, duke vendosur një aminoacid të ndryshëm në një nga 10 pozicionet kyçe të identifikuara nga puna e tyre me AlphaFold. Kjo i lejoi ata të gjenin një variant me aktivitet të ngjashëm me Cas9 normal në vendet që përputheshin me sekuencën e synuar, ndërsa aktiviteti i tij jashtë objektivit ra nga 28 përqind në 5 përqind. Rezultate të ngjashme ishin të mundshme kur studiuesit përdorën ARN udhëzuese të ndryshme. Ata gjithashtu treguan se qasja funksionoi për një sistem të ngjashëm që përdorte një proteinë të ndryshme Cas (Cas12) për të njohur kombinimin ADN/ARN udhëzuese.

Siç u përmend më sipër, ekipe të tjera kërkimore kanë përdorur qasje të ndryshme, siç është evolucioni i drejtuar, për të zhvilluar variante Cas9 që janë më pak të prirura ndaj redaktimit jashtë objektivit. Kur u testuan kundrejt këtyre varianteve, versionet e sapodizajnuara prireshin të prodhonin aktivitet dhe specifikë të ngjashme ose edhe pak më të mirë. Dallimi i madh këtu është se ndryshimet e identifikuara nga kjo qasje mund të jenë disi më specifike për një kombinim të caktuar të ARN-së udhëzuese/mospërputhjes sesa më efektive në përgjithësi.

Sigurisht, disa nga ndryshimet individuale të identifikuara këtu mund të kombinohen me ato në versionet e zhvilluara më parë të Cas9 për përmirësime edhe më të mëdha, megjithëse kjo nuk u testua këtu.

Sidoqoftë, puna është potencialisht e dobishme sepse përshkruan një metodë të përgjithshme për prodhimin e sistemeve të redaktimit të gjeneve të përshtatura për të parandaluar ngjarje të njohura jashtë objektivit. Nëse kjo përfundon duke qenë një pengesë në zhvillimin e një terapie, kjo punë mund të jetë një përparim i rëndësishëm. Por studiuesit sugjerojnë gjithashtu se qasja do të ishte e dobishme në përgjithësi për rregullimin e imët të ndërveprimeve proteinë-ADN, të cilat mund të kenë zbatime shumë përtej redaktimit të gjeneve.